Estudio de sensibilidad a fenhexamida y fenpirazamina en relación con la regulación del gen Erg27 en aislados chilenos de Botrytis cinerea

Abstract

La pudrición gris causada por Botrytis cinerea (Botrytis) es el principal problema fitopatológico en la producción de uva de mesa en Chile, y su control se basa, fundamentalmente, en la aplicación de fungicidas de síntesis. La hidroxianilida fenhexamida y la aminopirazolinona fenpirazamina, son dos moléculas claves que interrumpen la síntesis de ergosterol inhibiendo la enzima 3-ketoreductasa (3-KR), gatillando la muerte del patógeno. Mutaciones en el gen erg27, que conducen a cambios del aminoácido 412 en la 3- KR, conducen a la pérdida de sensibilidad a ambas moléculas. El laboratorio de Fitopatología Frutal y Molecular cuenta con una colección de aislados sensibles a fenhexamida y resistentes a fenpirazamina, o viceversa, sugiriendo la posible existencia de un mecanismo independiente a las mutaciones en erg27 asociados a la posición 412 de 3-KR como sustento de la pérdida de sensibilidad a fenhexamida/fenpirazamina. Distintos estudios reportan que cambios en la regulación transcripcional pueden alterar la sensibilidad a los fungicidas. Como aproximación, este trabajo tomó por objetivo el estudio de la región promotora de Erg27 en la población de interés (N=27 aislados). Se identificó la región promotora utilizando el genoma de la cepa B05.10 y se diseñaron partidores para amplificar tres fragmentos que permitieron secuenciar una región consenso de 1500 nucleótidos. Un total de seis aislados mostró una correlación directa entre cambios conservados en la región promotora y sensibilidad diferencial a fenhexamida y a fenpirazamina. Un grupo de aislados sensibles a fenhexamida y resistentes a fenpirazamina presentó el genotipo erg27G-233A/T-193A, mientras que un segundo grupo con moderada resistencia a fenhexamida y resistencia a fenpirazamina presentó el genotipo erg27G-615A/A-100G/C-74T. Notablemente, ningún aislado presentó deficiencias de fitness a nivel del crecimiento micelial bajo distintas temperaturas (15°C, 20°C y 25°C), producción de conidias o desarrollo de esclerocios. Los resultados indican que cambios en la región promotora son suficientes para modular la sensibilidad a fenhexamida/fenpirazamina, probablemente como resultado de cambios en los niveles de expresión de 3-KR o de enzimas con las que existe una regulación cruzada. No obstante, lo anterior, podrían existir otros mecanismos que permitan explicar la sensibilidad diferencial fenhexamida/fenpirazamina en aislados que no portan cambios en la región promotora de Erg27.

Gray mold caused by Botrytis cinerea (Botrytis) is the main phytopathological problem in table grapes production in Chile. Botrytis, and its control is based fundamentally, on the application of synthetic fungicides. The hydroxyanilide fenhexamid and the aminopyrazolinone fenpyrazamine are two key molecules that interrupt the synthesis of ergosterol by inhibiting the enzyme 3-ketoreductase (3-KR), triggering the death of the pathogen. Mutations in the erg27 gene, leading to changes at amino acid 412 in 3-KR, lead to a loss of sensitivity to both molecules. The laboratory of Fruit and Molecular Phytopathology has a collection of isolates sensitive to fenhexamid and resistant to fenpyrazamine, or vice versa, suggesting the possible existence of a mechanism independent of mutations in erg27, associated with position 412 of 3-KR, as support for the loss of sensitivity to fenhexamid/fenpyrazamine. Different studies report that changes in transcriptional regulation can alter sensitivity to fungicides. As an approximation, this work aimed to study the promoter region of Erg27 in the population of interest (N=27 isolates). The promoter region was identified using the genome of strain B05.10, and primers were designed to amplify three fragments, allowing sequencing a consensus region of 1500 nucleotides. A total of six isolates showed a direct correlation between conserved changes in the promoter region and differential sensitivity to fenhexamid and fenpyrazamine. A group of isolates sensitive to fenhexamid and resistant to fenpyrazamine presented the genotype erg27G-233A/T-193A, while a second group with moderate resistance to fenhexamid and resistance to fenpyrazamine presented the genotype erg27G-615A/A-100G/C-74T. Notably, no isolate presented fitness deficiencies in mycelial growth under different temperatures (15°C, 20°C, and 25°C), conidia production or sclerotia development. The results indicate that changes in the promoter region are sufficient to modulate sensitivity to fenhexamid/fenpyrazamine, probably due to changes in the expression levels of 3-KR or of enzymes with which there is cross- regulation. However, there could be other mechanisms that explain the differential fenhexamid/fenpyrazamine sensitivity in isolates that do not carry changes in the Erg27 promoter region.