Cambios bioenergéticos inducidos por la enzima convertidora de endotelina-1C en células de cáncer colorrectal

Abstract

Estudios previos realizados en nuestro laboratorio determinaron que la mutación puntual de la lisina 6 a arginina en la enzima convertidora de endotelina-1c (ECE-1cK6R) promueve su mayor estabilidad, así como también aumenta la agresividad y genera características de troncalidad en células de distintos tipos de cánceres, incluyendo colorrectal, pulmón y glioblastoma. Esto la posiciona como un potencial biomarcador de mal pronóstico. Si bien está demostrado que la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c en su extremo N-terminal, lo cual bloquea su degradación, promueve la agresividad y fomenta un fenotipo troncal, se desconoce de qué manera se promueven estas características y qué repercusión tiene en el metabolismo. Se sabe que las células troncales de cáncer de colon suelen presentar una mayor dependencia del metabolismo oxidativo. Por lo tanto, la hipótesis de esta tesis fue: “Una forma súper estable de la enzima convertidora de endotelina-1c (ECE-1cK6R) genera cambios metabólicos asociados a aumentos en la biogénesis y función mitocondrial en células de cáncer colorrectal”. Asimismo, el objetivo general de esta tesis fue caracterizar las consecuencias bioenergéticas de la sobreexpresión de ECE-1cK6R en células de cáncer colorrectal. Se establecieron los siguientes objetivos específicos: “1. Determinar si la mutante ECE-1cK6R promueve un aumento de la biogénesis mitocondrial”; “2. Estudiar si la mutante ECE-1cK6R conduce a un aumento de la función mitocondrial”; y “3. Evaluar si la mutante ECE-1cK6R promueve la adaptación a un medio deficiente en glucosa”. Para ello, se utilizaron células DLD-1 que sobreexpresan la isoforma ECE-1c en su forma salvaje (ECE-1cWT), súper-estable (ECE-1cK6R) y un vector vacío (Mock) como control. Se determinó mediante qPCR el número de copias de DNA mitocondrial, así como también la expresión de TFAM, un gen clave en la biogénesis mitocondrial. Con el análisis de western blot se midieron los niveles de proteínas de TFAM y PGC1-α. Además, se evaluó la biomasa mitocondrial mediante citometría de flujo y la evaluación de los niveles de la proteína TOMM20. Los resultados mostraron que la sobreexpresión de ECE-1cK6R favorece la replicación del genoma mitocondrial sin llegar a completar el proceso de generación de nuevas mitocondrias funcionales. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio determinaron que la mutación puntual de la lisina 6 a arginina en la enzima convertidora de endotelina-1c (ECE-1cK6R) promueve su mayor estabilidad, así como también aumenta la agresividad y genera características de troncalidad en células de distintos tipos de cánceres, incluyendo colorrectal, pulmón y glioblastoma. Esto la posiciona como un potencial biomarcador de mal pronóstico. Si bien está demostrado que la proteína kinasa CK2 fosforila a ECE-1c en su extremo N-terminal, lo cual bloquea su degradación, promueve la agresividad y fomenta un fenotipo troncal, se desconoce de qué manera se promueven estas características y qué repercusión tiene en el metabolismo. Se sabe que las células troncales de cáncer de colon suelen presentar una mayor dependencia del metabolismo oxidativo. Por lo tanto, la hipótesis de esta tesis fue: “Una forma súper estable de la enzima convertidora de endotelina-1c (ECE-1cK6R) genera cambios metabólicos asociados a aumentos en la biogénesis y función mitocondrial en células de cáncer colorrectal”. Asimismo, el objetivo general de esta tesis fue caracterizar las consecuencias bioenergéticas de la sobreexpresión de ECE-1cK6R en células de cáncer colorrectal. Se establecieron los siguientes objetivos específicos: “1. Determinar si la mutante ECE-1cK6R promueve un aumento de la biogénesis mitocondrial”; “2. Estudiar si la mutante ECE-1cK6R conduce a un aumento de la función mitocondrial”; y “3. Evaluar si la mutante ECE-1cK6R promueve la adaptación a un medio deficiente en glucosa”. Para ello, se utilizaron células DLD-1 que sobreexpresan la isoforma ECE-1c en su forma salvaje (ECE-1cWT), súper-estable (ECE-1cK6R) y un vector vacío (Mock) como control. Se determinó mediante qPCR el número de copias de DNA mitocondrial, así como también la expresión de TFAM, un gen clave en la biogénesis mitocondrial. Con el análisis de western blot se midieron los niveles de proteínas de TFAM y PGC1-α. Además, se evaluó la biomasa mitocondrial mediante citometría de flujo y la evaluación de los niveles de la proteína TOMM20. Los resultados mostraron que la sobreexpresión de ECE-1cK6R favorece la replicación del genoma mitocondrial sin llegar a completar el proceso de generación de nuevas mitocondrias funcionales.

Previous studies of our laboratory determined that the point mutation lysine 6-to-arginine of the endothelin-converting enzyme-1c (ECE-1cK6R) promotes its higher stability, as well as increases aggressiveness and generates stemness characteristics in cells from various types of cancer, including colorectal, lung, and glioblastoma. Thus, this position it as a potential biomarker of poor prognosis. Although it has been demonstrated that protein kinase CK2 phosphorylates ECE-1c at its N-terminus, which blocks its degradation, promotes aggressiveness, and fosters a stemness phenotype, how these characteristics are promoted and the impact they have on metabolism is unknown. It is recognized that colon cancer stem cells tend to exhibit a greater dependence on oxidative metabolism. Therefore, the hypothesis of this thesis was: “A super-stable form of the endothelin-converting enzyme-1c (ECE-1cK6R) generates metabolic changes associated with increases in mitochondrial biogenesis and function in colorectal cancer cells.” Likewise, the general objective of this thesis was to characterize the bioenergetic consequences of ECE-1cK6R overexpression in colorectal cancer cells, specifically related to mitochondrial function and structure, and how this influences the response to energetic stress. The following specific objectives were established: “1. To determine whether the ECE-1cK6R mutant promotes an increase in mitochondrial biogenesis”; “2. To study whether the ECE-1cK6R mutant leads to an increase in mitochondrial function”; and “3. To evaluate whether the ECE-1cK6R mutant promotes adaptation to a glucose-deficient environment.” To this end, DLD-1 cells overexpressing the wild-type (ECE-1cWT), super-stable (ECE-1cK6R), and an empty vector (Mock) were used as a control. Mitochondrial DNA copy number was determined using qPCR, as well as expression of TFAM, a key gene in mitochondrial biogenesis. Protein levels of TFAM and PGC1-α were measured using Western blot. Mitochondrial biomass was also assessed using flow cytometry and the TOMM20 protein. The results showed that overexpression of ECE-1cK6R promotes mitochondrial genome replication or activation of certain mitochondrial biogenesis pathways, but without completing the process of generating new functional mitochondria. To assess mitochondrial function, oxygen consumption was measured using the Seahorse apparatus. Significant difference was observed in ATP production. Mock cells did not respond efficiently to the uncoupler FCCP, whereas cells expressing ECE-1cK6R and ECE-1cWT increased their respiration in response to it, suggesting a greater functional respiratory reserve in cells overexpressing ECE-1c, independent of their stability. Given these changes, we investigated whether the mutant exhibited greater resistance to energy stress. To this end, various metabolic inhibitors were used. It was found that cells expressing ECE-1cK6R maintained their viability in presence of the GLUT1 inhibitor BAY-876, whereas cells expressing ECE-1cWT and Mock showed a 50% decrease in growth. Furthermore, when certain electron transport chain proteins were measured, cells expressing ECE-1cK6R showed lower levels of proteins associated with complexes I and III. Finally, to study whether glucose independence actually exists, an adhesion colony formation assay was performed. Contrary to our expectations, cells expressing ECE-1cK6R formed significantly fewer colonies compared to cells expressing ECE-1cWT and Mock, revealing that the ECE-1cK6R mutant does not exhibit independence from glycolytic metabolism. In summary, ECE-1CK6R expression promotes mitochondrial DNA replication and TFAM expression without changes in biomass. Furthermore, it could confer partial resistance to metabolic stress, although the cells remain dependent on glucose for growth.