Papel de Bcl-3 en la expresión de claudina-2 y la actividad de MLCK en el epitelio intestinal, como un mecanismo de regulación de la estructura de la unión estrecha

Abstract

El síndrome de intestino irritable (SII) es un desorden de la comunicación cerebro- intestino cuya fisiopatología involucra una elevada permeabilidad intestinal y un aumento de la activación inmune. Las proteínas de unión estrecha (UE) claudina-2 (clau-2) y Zonula ocludens-1 (ZO-1), así como la quinasa de la cadena liviana de miosina (MLCK) se han visto alteradas en su expresión y distribución en diversas cuadros inflamatorios intestinales, en donde fallas en la función de barrera intestinal y el aumento en la permeabilidad paracelular, se asocian a la severidad clínica de los pacientes. La proteína Bcl-3 (B-cell leukemia/lymphoma-3), regulador transcripcional de diversos genes inflamatorios y estructurales, posee una expresión aumentada en pacientes con SII. El papel de Bcl-3 en la regulación de la estructura de UE en el SII no ha sido descrito anteriormente. El objetivo de este trabajo fue demostrar que Bcl-3 induce la expresión in vitro de clau-2 y MLCK en el epitelio intestinal, asociado a cambios en la distribución intracelular de ZO-1. Para ello, en las líneas celulares DLD-1 y caco-2 se procedió a modular la expresión de Bcl-3 mediante transfección con un vector de expresión y ARN interferente pequeño (siRNA), para sobreexpresión y silenciamiento de esta proteína, respectivamente. Bajo estas condiciones, se determinaron los cambios en la expresión de clau-2 y MLCK, mediante q-PCR y western blot, siendo evaluados los cambios en la distribución de ZO-1 mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI). La actividad de MLCK fue medida a través de la determinación de la razón de la fosforilación de la cadena liviana de miosina (MLC) versus la MLC total, por western blot. Nuestros resultados mostraron que la inducción de aumento de la expresión de Bcl-3 in vitro conduce a aumentos en los niveles de clau-2 y MLCK, una mayor actividad de MLCK y una relocalización de ZO-1 desde la membrana plasmática hacia el citoplasma de la célula. Nuestras evidencias sugieren un posible rol regulador de Bcl-3 en la composición estructural y arquitectura de la UE. Debido a que resultados previos indicaron un aumento de los niveles de Bcl-3 y cambios estructurales en la UE de pacientes con SII futuras investigaciones destinadas a comprender el papel de Bcl-3 en el aumento de la permeabilidad paracelular en el epitelio intestinal permitirá contribuir al conocimiento de la fisiopatología del SII.

Irritable Bowel Syndrome (IBS) is a brain-gut communication disorder whose pathophysiology involves increased intestinal permeability and increased immune activation. The tight junction proteins (TJ) claudin-2 (clau-2) and Zonula occludens (ZO-1), as well as myosin light chain kinase (MLCK) have been observed as altered in various intestinal inflammatory conditions, were failures of the intestinal barrier function and increased paracellular permeability are associated with clinical severity of patients. The Bcl-3 protein (B-cell leukemia / lymphoma-3), is a transcriptional regulator of diverse inflammatory and cellular structural genes. Bcl-3 has an increased expression in IBS patients. The role of Bcl-3 in the regulatory mechanism of the TJ structure underlying IBS has not been previously described. The objective of this work was to demonstrate that Bcl-3 induces the in vitro expression of clau-2 and MLCK in the intestinal epithelium, which can be associated with changes in the intracellular distribution of ZO-1. For this, DLD-1, and caco-2 cell lines, were modulated for Bcl-3 expression by transfection technique using an expression vector or small interfering RNA (siRNA), to overexpress or silencing of Bcl-3 protein, respectively. Under these conditions, the changes in clau-2 and MLCK expression were evaluated by q-PCR and western blot, as well as the ZO-1 distribution by indirect immunofluorescence (IFI). MLCK activity was determined by the ratio of myosin light chain phosphorylation (MLC) versus total MLC, by western blot. Our results showed that the induction of increased expression of Bcl-3 in vitro leads to increases clau-2 and MLCK levels, MLCK activity and a ZO-1 relocation from the plasma membrane to the cytoplasm. Our evidence suggests a possible regulatory role for Bcl-3 in the structural composition and architecture of the TJ. Future research aimed at understanding the role of this mechanism in increasing paracellular permeability in the intestinal epithelium will contribute to the understanding of the pathophysiology of IBS.