Poliplexos conjugados con péptido de penetración celular (TAT) : efecto de las condiciones de síntesis en su transfección celular in vitro

Abstract

Las terapias farmacológicas han sido tradicionalmente desarrolladas a partir de moléculas de síntesis química. No obstante, avances recientes en farmacología han explorado nuevas estrategias basadas en elementos bioactivos, como por ejemplo la utilización de ácido nucleicos. Esto, debido a su capacidad para intervenir directamente en el origen de diversas patologías. A pesar de su potencial terapéutico, estos compuestos presentan limitaciones farmacocinéticas, como su gran tamaño molecular, carga eléctrica, inmunogenicidad y rápida degradación metabólica. Por ello, la optimización de estos sistemas sigue siendo un área clave de investigación. En el presente proyecto propusimos un complejo polipléxico funcionalizado con un péptido penetrador celular (CPP). El complejo está basado en un polímero catiónico de alto peso molecular (25 kDa PEI), de cadena lineal o ramificada (l-PEI o r-PEI, respectivamente) y su contraparte aniónica, un plásmido de gran uso en investigación biofarmacéutica (pAAV-CMV-GFP). Estos dos componentes se auto ensamblan cuando interactúan electrostáticamente (por medio de interacción de los grupos fosfato del ADN con los grupos amino del bloque PEI), así dando lugar a estructuras que encapsulan el ADN con gran eficiencia, llamados Poliplexos (PPs). El Péptido de proteína Tat del VIH-1 (TAT) se adosa a la fracción polimérica del complejo y pretende proteger y guiar dos de las etapas más cruciales en la entrega del cargo nucleotídico: atravesar la membrana y el escape endosomal. Este péptido facilita la internalización celular mediante su dominio básico rico en argininas y lisinas. Su mecanismo implica interacciones electrostáticas con proteoglicanos de la membrana (como heparán sulfato), promoviendo la endocitosis mediada por macropinocitosis o mediada por caveolinas. Los complejos fueron formados exitosamente, evaluando su integridad mediante electroforesis. Los complejos presentaron tamaños entre 348,6 ± 19,6 y 408,7 ± 27,8 nm, índice de polidispersidad (PDI) entre 0,485 ± 0,03 y 0,636 ± 0,05 y potencial Zeta (ζP) entre 6,81 ± 4,2 y 8,98 ± 3,4 mV, dependiendo del tipo de complejo formado. Los complejos demostraron ser resistentes ante nucleasas dependiente de su concentración. Por último, la eficiencia de transfección fue evaluada por citometría de flujo en dos líneas celulares competentes: HEK-293 y H-4-II-E-C3, en donde en estas últimas se observó que la presencia del péptido TAT incrementó en 2,3 veces la fluorescencia comparado con su contraparte no funcionalizada.