Nanopartículas de oro conjugadas con un inhibidor de la proteína de activación de fibroblastos (FAP) para la evaluación de la fibrosis cardíaca

Abstract

Introducción: Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte a nivel mundial, y la fibrosis cardíaca constituye un factor de riesgo para un peor pronóstico de ECV. Eventos como el infarto agudo de miocardio o patologías crónicas como la hipertensión arterial, pueden desencadenar diferentes tipos de fibrosis cardíaca. Actualmente, su diagnóstico depende de métodos invasivos y poco sensibles, como la biopsia endomiocárdica. En este contexto, la proteína FAP, expresada en fibroblastos cardíacos activados, surge como una diana molecular prometedora para el diagnóstico y el tratamiento. Los inhibidores de FAP tales como el FAPI y las nanopartículas de oro, por su capacidad de funcionalización, alta biocompatibilidad y por sus propiedades como el contraste frente a los rayos X, ofrecen una plataforma innovadora para el desarrollo de estrategias de diagnóstico y terapia dirigidas en fibrosis cardíaca. Objetivo general: “Sintetizar y evaluar el nanosistema compuesto por nanoesferas de oro, PEG y el inhibidor de la proteína de activación de fibroblastos, para la detección de la proteína FAP in vitro e in vivo”. Metodología: Se diseñó un nanosistema compuesto por nanoesferas de oro, recubiertas con PEG y conjugadas con el FAPI (AuNp-PEG-F). El nanosistema fue sintetizado y caracterizado, en cada etapa, mediante las técnicas: espectroscopia UV-Vis, STEM, DLS, Potencial Z y Raman. Se realizó un estudio in sílico de modelación molecular. Se evaluó la citotoxicidad del nanosistema mediante los ensayos Azul de Tripán y LDH, en cultivos celulares de fibroblastos cardíacos y cardiomiocitos. Para evaluar la detección del AuNp-PEG-F se utilizó un modelo in vitro de fibrogénesis cardíaca. Los fibroblastos cardíacos se estimularon con TGF-β 10 ng/ml 72 horas. Posteriormente se incubaron con AuNp-PEG-F 1 nM y se detectó oro mediante el ensayo de Gold Enhancement. Por último, fue evaluada la capacidad de detección de AuNp-PEG-F, en un modelo in vivo de hipertensión arterial inducida por la administración de angiotensina II cargada en bombas Alzet a ratones C57BL/6N. El AuNp-PEG-F fue administrado por vía intravenosa durante 40 min. Se realizaron estudios histológicos y de absorción atómica para detectar el AuNp-PEG-F en las regiones de daño fibrótico en el corazón. Resultados: Se obtuvo el nanosistema AuNp-PEG-F, con el tamaño (AuNp≈12 nm), la forma y estabilidad coloidal esperada. Se demostró, in sílico, la estabilidad de la unión del nanosistema al sitio activo de FAP durante 300 ns de simulación. El nanosistema no afectó a la viabilidad celular in vitro de fibroblastos cardíacos y cardiomiocitos, en el rango de concentraciones de 0.125-1 nM. El TGF-β1 10 ng/ml indujo la diferenciación de fibroblastos cardíacos a un fenotipo contráctil de miofibroblasto cardíaco luego de 72 horas de tratamiento observándose un aumento en los niveles de proteínas como Colágeno-I, Fibronectina, α-SMA y FAP. El ensayo de Gold Enhancement en fibroblastos cardiacos, mostró un aumento de la señal del oro alrededor de las células diferenciadas. Los estudios in vivo demostraron desarrollo de fibrosis cardíaca de tipo perivascular e intersticial y un aumento de la expresión de FAP. Mediante Gold Enhancement en tejido de corazón, se detectó una mayor acumulación del nanosistema en las regiones de daño fibrótico, en los ratones tratados con Ang II y AuNp-PEG-F. Este resultado coincidió con los análisis de absorción atómica, que mostraron más oro en los corazones con fibrosis cardíaca. Conclusiones: El nanosistema AuNp-PEG-F es estable según las condiciones evaluadas en este estudio. Se evidenció una acumulación de AuNp-PEG-F en miofibroblastos cardíacos donde hay una mayor expresión de FAP. El AuNp-PEG-F se acumuló selectivamente en áreas fibróticas, inducida por angiotensina II en ratones, confirmando su potencial para el diagnóstico de la fibrosis cardíaca.

Introduction: Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide, and cardiac fibrosis constitutes a risk factor for a worse prognosis of CVD. Events such as acute myocardial infarction or chronic pathologies such as arterial hypertension can trigger different types of cardiac fibrosis. Its diagnosis depends on invasive and insensitive methods, such as endomyocardial biopsy. In this context, the FAP protein, expressed in activated cardiac fibroblasts, emerges as a promising molecular target for diagnosis and treatment. FAP inhibitors, such as FAPI and gold nanoparticles, due to their functionalization capacity, high biocompatibility, and properties like X-ray contrast, offer an innovative platform for the development of diagnostic and targeted therapy strategies in cardiac fibrosis. General objective: “To synthesize and evaluate the nanosystem composed of gold nanospheres, PEG and the inhibitor of fibroblast activation protein, for the detection of FAP protein in vitro and in vivo”. Methodology: A nanosystem of gold nanospheres was designed, coated with PEG, and conjugated with FAPI (AuNp-PEG-F). The nanosystem was synthesized and characterized at each stage by UV-Vis, STEM, DLS, Z-potential, and Raman spectroscopy techniques. An in silico molecular modeling study was made. The cytotoxicity of the nanosystem was evaluated by Trypan blue and LDH assays in cardiac fibroblast and cardiomyocyte cell cultures. An in vitro model of cardiac fibrogenesis was used to assess AuNp-PEG-F detection. Cardiac fibroblasts were stimulated with TGF-β (10 ng/ml) for 72 h. They were then incubated with 1 nM AuNp-PEG-F, and the Gold Enhancement assay detected gold. Finally, the detection ability of AuNp-PEG-F was evaluated in an in vivo model of arterial hypertension induced by administration of Angiotensin II loaded Alzet pumps to C57BL/6N mice. AuNp-PEG-F was administered intravenously for 40 min. Histological and atomic absorption studies were made to detect AuNp-PEG-F in regions of fibrotic damage in the heart. Results: The AuNp-PEG-F nanosystem was obtained, with the expected size (AuNp≈12 nm), shape, and colloidal stability. The stability of the binding of the nanosystem to the active site of FAP during 300 ns of simulation was demonstrated in silico. The nanosystem did not affect the in vitro cell viability of cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in the concentration range of 0.125-1 nM. TGF-β1 (10 ng/ml) induced differentiation of cardiac fibroblasts to a contractile cardiac myofibroblast phenotype after 72 h of treatment by observing an increase in protein levels such as collagen-I, fibronectin, α-SMA and FAP. Gold Enhancement assay in cardiac fibroblasts showed increased gold signal around the differentiated cells. In vivo studies demonstrated the development of perivascular and interstitial cardiac fibrosis, and increased FAP expression. By Gold Enhancement in heart tissue, an increased accumulation of the nanosystem in the regions of fibrotic damage was detected in mice treated with angiotensin II and AuNp-PEG-F. This result is consistent with atomic absorption analysis, which found higher gold levels in hearts with cardiac fibrosis. Conclusions: The AuNp-PEG-F nanosystem is stable under the conditions evaluated in this study. An accumulation of AuNp-PEG-F was evident in cardiac myofibroblasts where there is increased expression of FAP. AuNp-PEG-F accumulated selectively in fibrotic areas, induced by angiotensin II in mice, confirming its potential for diagnosing cardiac fibrosis.