Rol del extremo N-terminal de la enzima convertidora de endotelina-1c en su localización subcelular y en la adquisición de rasgos asociados a malignidad en células de cáncer de colon

Abstract

La isoforma c de la enzima convertidora de endotelina-1 (ECE1c) ha sido asociada a la progresión tumoral en diversos tipos de cáncer, incluido el cáncer colorrectal, donde su sobreexpresión se correlaciona con un fenotipo altamente maligno. Aunque se ha demostrado previamente que la fosforilación del extremo N-terminal de ECE1c por la proteína quinasa CK2 incrementa su estabilidad y potencia propiedades agresivas en células tumorales, los mecanismos moleculares asociados a dicho fenómeno permanecen sin ser dilucidados. En este contexto, la hipótesis propuesta para esta tesis fue que el cambio de la lisina 6 a arginina en el extremo N-terminal de la Enzima Convertidora de Endotelina-1c aumenta su estabilidad y, de esta forma, regula su localización subcelular y la aparición de rasgos asociados a malignidad en células de cáncer colorrectal de manera independiente de su actividad enzimática. Como objetivo general se quiso demostrar si la localización subcelular de la ECE1c y algunos rasgos asociados a malignidad, como mayor proliferación, migración y resistencia a la muerte, en células DLD-1 de cáncer colorrectal, son reguladas por el cambio Lys-6-Arg en el extremo N-terminal y además de manera independiente de la actividad catalítica de la enzima y finalmente los objetivos específicos a resolver fueron: determinar si el cambio Lys-6-Arg en el extremo N-terminal de ECE1c afecta la estabilidad de la proteína de fusión NTK6R-GFP; Estudiar si el cambio Lys-6-Arg en el extremo N-terminal de ECE1c tiene un efecto en la localización subcelular de la proteína de fusión NTK6R-GFP y evaluar si la expresión de NTK6R-GFP tiene un efecto en algunos rasgos asociados a malignidad, como mayor proliferación, migración y resistencia a la muerte. Para ello, se generaron proteínas recombinantes consistentes en el extremo N-terminal y el dominio transmembrana de ECE1c, en su forma silvestre (WT) o portando la mutación Lys-6-Arg (K6R) que confiere superestabilidad, fusionados a la proteína fluorescente verde (GFP), las cuales fueron expresadas transitoriamente en células DLD-1. La estabilidad proteica se evaluó mediante un ensayo con cicloheximida, en presencia o ausencia del inhibidor de CK2 silmitasertib. La localización subcelular se analizó mediante microscopía confocal e inmunocitoquímica, utilizando marcadores específicos de retículo endoplasmático rugoso (RER) y compartimentos endosomales. Finalmente, se evaluaron parámetros funcionales asociados a malignidad tumoral, como proliferación celular, resistencia al antineoplásico 5-fluorouracilo (5-FU) y capacidad migratoria. Los resultados mostraron que la mutación K6R confiere una marcada estabilidad a la proteína de fusión, lo cual se observa especialmente en presencia del inhibidor de CK2, silmitasertib, evidenciando que la lisina 6 del extremo N-terminal es un residuo crítico en la degradación proteica de ECE1c. Adicionalmente, se observó que el extremo N-terminal es suficiente para dirigir la localización subcelular de GFP, mostrando un patrón citoplasmático asociado a distintos organelos, lo que se determinó a través de los marcadores específicos GRP78 (RER), Rab7 (endosomas tardíos) y CD63 (vía endosomal). Nuestros resultados indicaron que la variante superestable NTK6R-GFP tiene una distribución preferencial a la vía endosomal, con una colocalización significativamente aumentada en estructuras dentro de la vía endosomal. A nivel funcional, la expresión de NTK6R-GFP promovió un aumento significativo de la proliferación y otorgó una mayor resistencia a 5-FU en las células DLD-1, aunque no se detectaron diferencias en la capacidad migratoria evaluada mediante el ensayo de cierre de herida. En conjunto, estos resultados demuestran que la mayor estabilidad de ECE1c juega un rol clave tanto en la localización subcelular de la enzima como en la expresión de un fenotipo maligno en células de cáncer colorrectal. Notablemente, esto estaría ocurriendo de manera independiente de la actividad catalítica de la enzima y del eje clásico de señalización de endotelina-1. Este estudio aporta evidencia de un mecanismo no canónico de acción de ECE1c y posiciona a la fosforilación de su extremo N-terminal por CK2 como un potencial marcador de mal pronóstico, así como un blanco terapéutico emergente en cáncer colorrectal.

The endothelin–converting enzyme-1 isoform c (ECE1c) has been associated with tumor progression in various types of cancer, including colorectal cancer, where its overexpression correlates with a highly malignant phenotype. Although it has been previously demonstrated that phosphorylation of the N-terminal end of ECE1c by protein kinase CK2 increases its stability and enhances aggressive properties in tumor cells, the molecular mechanisms associated with this phenomenon remain to be elucidated. In this context, the hypothesis proposed for this thesis was that the substitution of lysine 6 by arginine at the N-terminal end of endothelin-converting enzyme-1c increases its stability and, in this way, regulates its subcellular localization and the emergence of malignancy-associated traits in colorectal cancer cells independently of its enzymatic activity. The general objective was to determine whether the subcellular localization of ECE1c and certain malignancy-associated traits, such as increased proliferation, migration, and resistance to cell death, in DLD-1 colorectal cancer cells are regulated by the Lys-6-Arg substitution at the N-terminal end and, moreover, independently of the catalytic activity of the enzyme; finally, the specific objectives to be addressed were: to determine whether the Lys-6-Arg substitution at the N-terminal end of ECE1c affects the stability of the NTK6R-GFP fusion protein; to study whether the Lys-6-Arg substitution at the N-terminal end of ECE1c has an effect on the subcellular localization of the NTK6R-GFP fusion protein; and to evaluate whether the expression of NTK6R-GFP has an effect on certain malignancy-associated traits, such as increased proliferation, migration, and resistance to cell death. To this end, recombinant proteins consisting of the N-terminal end and the transmembrane domain of ECE1c, in its wild-type (WT) form or carrying the Lys-6-Arg (K6R) mutation that confers super-stability, fused to green fluorescent protein (GFP), were generated and transiently expressed in DLD-1 cells. Protein stability was evaluated by a cycloheximide chase assay, in the presence or absence of the CK2 inhibitor silmitasertib. Subcellular localization was analyzed by confocal microscopy and immunocytochemistry, using specific markers of the rough endoplasmic reticulum (RER) and endosomal compartments. Finally, functional parameters associated with tumor malignancy, such as cell proliferation, resistance to the antineoplastic agent 5-fluorouracil (5-FU), and migratory capacity, were evaluated. The results showed that the K6R mutation confers marked stability to the fusion protein, which is particularly evident in the presence of the CK2 inhibitor silmitasertib, demonstrating that lysine 6 at the N-terminal end is a critical residue in the protein degradation of ECE1c. Additionally, it was observed that the N-terminal end is sufficient to direct the subcellular localization of GFP, showing a cytoplasmic pattern associated with different organelles, as determined through the specific markers GRP78 (RER), Rab7 (late endosomes), and CD63 (endosomal pathway). Our results indicated that the super-stable NTK6R-GFP variant shows preferential distribution to the endosomal pathway, with significantly increased colocalization within structures of the endosomal pathway. At a functional level, the expression of NTK6R-GFP promoted a significant increase in proliferation and conferred greater resistance to 5-FU in DLD-1 cells, although no differences were detected in migratory capacity as evaluated by the wound healing assay. Taken together, these results demonstrate that increased stability of ECE1c plays a key role in both the subcellular localization of the enzyme and the expression of a malignant phenotype in colorectal cancer cells. Notably, this appears to occur independently of the catalytic activity of the enzyme and of the classical endothelin-1 signaling axis. This study provides evidence of a non-canonical mechanism of action of ECE1c and positions phosphorylation of its N-terminal end by CK2 as a potential marker of poor prognosis, as well as an emerging therapeutic target in colorectal cancer.