Efecto de la actividad de PAK en el crecimiento de neuritas, en un modelo celular del Síndrome de Down

Abstract

El Síndrome de Down (SD) es la aneuploidía cromosómica que con mayor frecuencia sobrevive la gestación y representa la causa más común de déficit cognitivo de origen genético. La base genética del SD es la trisomía total o parcial del cromosoma 21, por lo cual se postula que el exceso de dosis génica asociado a este cromosoma es el responsable de las alteraciones multisistémicas que presentan los pacientes con esta patología. Dentro de estos cambios, se ha descrito que los pacientes con SD presentan reducción del tamaño del hipocampo y el cerebelo. Además, se han observado anomalías morfológicas en las espinas dendríticas de las neuronas piramidales en la corteza motora de pacientes con SD. Entre los genes sobreexpresados en el cromosoma 21 y que se relacionan con el desarrollo y la función neuronal, se encuentra el gen que codifica para la proteína precursora de amiloide (APP), proteína que tiene múltiples funciones en el desarrollo y trofismo del sistema nervioso central, entre ellas se encuentra su influencia en la proliferación celular, diferenciación, crecimiento de neuritas, adhesión celular y sinaptogénesis. Una de las vías por la cual el APP podría incidir en la dinámica del citoesqueleto celular es mediante la activación de quinasas activadas por p21 (PAK), las que se relacionan directamente con procesos fisiológicos neuronales. Las PAK son los principales efectores de las pequeñas Rho GTPasas de la familia Rac1 y Cdc42, pero también se ha determinado que la sobreexpresión de APP, específicamente del péptido C31 que es liberado por la acción de caspasas, puede inducir la activación de la vía PAK y de esta manera incidir en la dinámica del citoesqueleto de actina. La desregulación de la vía PAK y en este caso el aumento de la actividad de PAK, genera alteraciones morfológicas características que subyacen el daño neurológico y déficit cognitivo, ya que altera la dinámica de actina mediante fosforilación de la quinasa con dominio LIM (LIMK) y cofilina, afectando así la estabilidad de los filamentos de actina, desencadenando una disminución de las espinas dendríticas y disminución del crecimiento del axón. Por lo tanto, parece muy relevante determinar si existe alteración de la actividad de PAK en un modelo celular del SD. Para ello, utilizamos una línea celular neuronal llamada CTb, establecida desde la corteza cerebral de ratón trisómico 16, modelo celular animal de la condición humana. Considerando lo anterior, se postula la siguiente hipótesis: la actividad aumentada de la vía PAK en las células trisómicas CTb, modelo celular del Síndrome de Down, impacta negativamente la capacidad de extensión de procesos neuríticos, alteración que puede revertirse farmacológicamente con el inhibidor de la activación de PAK FRAX 486. Usando la línea celular CTb antes mencionada, se determinaron las características celulares que influyen en la activación de PAK, tales como; la expresión de APP, activación de caspasas, expresión del corte C-terminal de APP. Posteriormente, realizamos el análisis morfológico del crecimiento de neuritas mediante análisis de Sholl, para evaluar la ramificación de los procesos en las líneas celulares sometidas a diferenciación in vitro. Para profundizar el análisis morfológico, desarrollamos cinco nuevos algoritmos que nos ayudaron a analizar la formación y la pérdida de procesos, tras la inhibición de la activación de PAK1 con FRAX 486, un conocido inhibidor de la actividad de PAK. En consecuencia, observamos que las células CTb presentan condiciones que se pueden relacionar con la activación de PAK y que tras la inhibición de la actividad de la quinasa con FRAX 486 aumenta la formación de nuevos procesos, así como también la pérdida de ellos. Finalmente, consideramos importante determinar cómo la hiperfosforilación de PAK puede incidir en procesos dependientes de la dinámica de actina, tales como la elongación y el crecimiento de neuritas, permitiéndonos conocer procesos claves que puedan determinar la evaluación de nuevos blancos terapéuticos en un modelo del SD.

Down Syndrome (DS) is the chromosomal aneuploidy that most frequently survives gestation, and it represents the most frequent cause of cognitive impairment of genetic origin. The genetic basis of DS is a total or partial trisomy of chromosome 21, which presents the excess gene dosage associated with this chromosome as responsible for the multisystem impairments associated with this condition. In this regard, it is known that patients with DS present a reduced size of the hippocampus and cerebellum. In addition, morphological abnormalities have been observed in the dendritic spines of pyramidal neurons in the motor cortex of DS patients. Among the overexpressed genes on chromosome 21 that are related to neuronal development and function, is the gene that encodes for the amyloid precursor protein (APP), a protein that has multiple functions in development and trophism of the central nervous system. Among them are cell proliferation, differentiation, neurite growth, cell adhesion and synaptogenesis. One of the pathways by which APP may influence cell cytoskeleton dynamics is through the activation of p21-activated kinases (PAKs), which are directly related to neuronal physiological processes. PAKs are the main effectors of the small Rho GTPases of the Rac1 and Cdc42 family. However, the overexpression of APP, specifically the C31 peptide that is released by the action of caspases, can induce the activation of the PAK pathway and thus influence the dynamics of the actin cytoskeleton. The deregulation of the PAK pathway, in this case resulting in increased PAK activity, can generate characteristic morphological alterations that underlie neuronal damage and cognitive deficit. Indeed, increased PAK activity alters actin dynamics through hyperphosphorylation of LIM domain kinase (LIMK) and cofilin, thus affecting the stability of actin filaments, triggering a decrease in dendritic spines and decreased axon growth. Therefore, it seems most relevant to determine if there is a deregulation in PAK activity in a cellular model of DS. To achieve this goal, we used a neuronal cell line called CTb, established from the cerebral cortex of a trisomic 16 mouse, an animal cell model of the human condition. Considering the above, we proposed the following hypothesis: the increased activity of the PAK pathway in CTb trisomic cells, a cellular model of DS, negatively impacts their capacity for extension of neuritic processes, an alteration that can be reversed pharmacologically with the known PAK inhibitor, FRAX 486. Using the aforementioned cell line, we studied cellular characteristics that influence PAK activation, such as; APP expression, caspase activation, expression levels of the cleaved C-terminal of APP. Subsequently, we performed the morphological analysis of neurite outgrowth using Sholl analysis, to evaluate the branching of the processes in the cell lines under in vitro differentiation. To further the morphological analysis, we developed five new algorithms that helped us analyze the formation and loss of processes, following the inhibition of PAK1 activation with FRAX 486. Consequently, we observed that CTb cells present conditions that can be related to PAK activation and that after inhibition of kinase activity with FRAX 486, the formation of new processes increases, as well as their loss. Finally, we believe it is important to determine how PAK hyperphosphorylation can affect processes dependent on actin dynamics, such as neurite elongation and growth. This could elucidate key processes that can determine the evaluation of new therapeutic targets in a DS model.