Inhibición de la expresión génica, proteica y de la actividad enzimática de la salsolinol sintasa de rata mediante un shRNA in vitro

Abstract

El trastorno por consumo de alcohol (AUD) se asocia con la acción de metabolitos del etanol, como el salsolinol (SAL), cuyo enantiómero R ejerce efectos reforzantes en el sistema mesocorticolímbico y podría contribuir a la adicción. La salsolinol sintasa, recientemente aislada y secuenciada, es una proteína de bajo peso molecular que cataliza, en forma enantioselectiva, la conversión de dopamina (DA) y acetaldehído (ACD) en salsolinol (R-SAL), pero no existen metodologías para estudiar su expresión génica y proteica, así como su actividad enzimática. Los RNA de horquilla corta (shRNA), al degradar específicamente el RNA mensajero (mRNA), resultan ideales para validar blancos terapéuticos y emular el efecto de inhibidores farmacológicos. Por lo tanto, esta tesis tuvo como objetivo desarrollar metodologías para cuantificar la expresión génica y proteica, así como la actividad enzimática de la salsolinol sintasa en células HEK-293, y generar un shRNA dirigido a su mRNA. Se diseñó una metodología de RT-qPCR (PCR cuantitativa con transcripción inversa) capaz de detectar selectivamente el transcrito de la salsolinol sintasa. Para evaluar la actividad enzimática, se implementó un sistema de cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a detección electroquímica (HPLC-EC), que permitió separar y detectar los enantiómeros R/S-SAL. A nivel proteico, se estableció el uso de electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en tampón Tris–Tricina, para la separación de proteínas de bajo peso molecular. Paralelamente, se clonó un shRNA en el vector pLKO.3G, lo que constituye la primera construcción reportada dirigida contra el transcrito de la salsolinol sintasa. El shRNA produjo una disminución estadísticamente significativa del 17% en la expresión relativa, lo que valida su funcionalidad. Sin embargo, debido a la falta de un anticuerpo específico comercial, no fue posible cuantificar la proteína mediante Western Blot. Además, la formación de salsolinol no mostró cambios significativos en la razón R/S al emplear lisados de células que sobreexpresaban la enzima, lo que impidió detectar dicha actividad. En conjunto, estos resultados establecen un marco metodológico para estudiar la salsolinol sintasa mediante RTqPCR en modelos celulares, confirman un knockdown parcial de su expresión génica y resaltan la necesidad de optimizar sistemas de detección proteica y funcional, idealmente en líneas neuronales y mediante el desarrollo de un anticuerpo específico, para su estudio como posible blanco terapéutico en el AUD.

Alcohol use disorder (AUD) is associated with the action of ethanol metabolites such as salsolinol (SAL), whose R enantiomer exerts reinforcing effects in the mesocorticolimbic system and may contribute to addiction. The recently isolated and sequenced salsolinol synthase is a low–molecular weight protein that catalyzes, in an enantioselective manner, the conversion of dopamine (DA) and acetaldehyde (ACD) into salsolinol (R-SAL), but there are currently no methodologies to study its gene and protein expression, or its enzymatic activity. Short hairpin RNAs (shRNA), by specifically degrading messenger RNA (mRNA), are ideal tools to validate therapeutic targets and to mimic the effect of pharmacological inhibitors. Therefore, the aim of this thesis was to develop methodologies to quantify gene and protein expression, as well as the enzymatic activity of salsolinol synthase in HEK-293 cells, and to generate an shRNA directed against its mRNA. An RT-qPCR (reverse transcription quantitative PCR) methodology was designed to selectively detect the salsolinol synthase transcript. To evaluate enzymatic activity, a high-performance liquid chromatography system coupled to electrochemical detection (HPLC-EC) was implemented, which enabled the separation and detection of the R/S-SAL enantiomers. At the protein level, the use of sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) in Tris–Tricine buffer was established for the separation of low– molecular weight proteins. In parallel, an shRNA was cloned into the pLKO.3G vector, representing the first reported construct directed against the salsolinol synthase transcript. The shRNA produced a statistically significant 17% decrease in relative expression, validating its functionality. However, due to the lack of a specific commercial antibody, it was not possible to quantify the protein by Western blot. In addition, salsolinol formation did not show significant changes in the R/S ratio when using lysates from cells overexpressing the enzyme, which prevented detection of this activity. Taken together, these results establish a methodological framework to study salsolinol synthase by RT-qPCR in cellular models, confirm a partial knockdown of its gene expression, and highlight the need to optimize protein and functional detection systems, ideally in neuronal cell lines and through the development of a specific antibody, in order to investigate its potential as a therapeutic target in AUD.