Modulación del calcio intracelular por insulina en el cardiomiocito de rata adulta

Abstract

El cardiomiocito adulto es una célula terminalmente diferenciada con escasa capacidad replicativa y responsable de la contracción del miocardio. El ión calcio en conjunto con el AMP cíclico son los segundos mensajeros que regulan la contracción del cardiomiocito. Por otra parte la diabetes mellitus tipo II se asocia a un mayor riesgo cardiovascular (“cardiomiopatía diabética”), siendo muy frecuentes alteraciones sistólicas y diastólicas en el corazón de un paciente diabético. Dado que insulina es la principal hormona asociada a la diabetes es importante determinar si existe alguna relación entre ella y el calcio en el cardiomiocito adulto. En una investigación previa de nuestro Laboratorio se describió que insulina aumenta el calcio intracelular en cultivos primarios de cardiomiocitos neonatos, presentando esta respuesta dos componentes, uno rápido dependiente del calcio externo y el canal tipo L y receptor de ryanodina y otro lento dependiente de la vía transduccional IP3/receptor IP3. Interesantemente, este último componente media los efectos de insulina a nivel de la translocación del GLUT4 a la membrana plasmática y el posterior ingreso de glucosa a estas células. En base a estos antecedentes se propuso en esta memoria como hipótesis que insulina también aumenta los niveles intracelulares de Ca2+ en el cardiomiocito adulto a través de un mecanismo dependiente del Ca2+ extracelular y del almacenado en reservorios intracelulares. Nuestro objetivo consistió en estudiar la activación del sistema de señalización río abajo del receptor de insulina y su dependencia del calcio y el efecto tanto de insulina como IGF-1 en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito adulto de rata. Las células se expusieron a insulina 100 nM por distintos períodos de tiempo y se evaluó la activación del receptor mediante su autofosforilación en tirosina y de las proteínas kinasas Akt (Ser 473) y Erk 1/2 mediante Western blot. La presencia del receptor de insulina en el cardiomiocito de rata adulta se detectó por inmunofluorescencia en tyr1150/1151. Las tres proteínas evaluadas alcanzaron un máximo de activación significativo con respecto a los controles a los 5 min post- estímulo con insulina. Por otra parte, las células preincubadas con la sonda fluorescente para calcio Fluo3- AM se estudiaron por microscopía confocal para determinar cambios en los niveles de calcio intracelulares inducidos por insulina e IGF-1. Ambos péptidos no produjeron aumentos significativos en los niveles de calcio intracelulares tanto en medio de reposo sin calcio como en medio de reposo con calcio y evaluando distintas zonas celulares y concentraciones de los compuestos, mientras que conocidos estímulos (ionomicina y KCl), empleados como controles positivos, aumentaron el calcio intracelular. Asimismo, insulina e IGF-1 no modificaron la frecuencia de contracción del cardiomiocito adulto. Sin embargo, ensayos de fosforilación de la proteína Akt (Ser 473) en ausencia de calcio intracelular mediante el uso de BAPTA-AM mostraron niveles inferiores a los observados en presencia de este catión. En cambio, la fosforilación del receptor de insulina no se modificó al quelar el calcio intracelular en el cardiomiocito adulto. Estos resultados sugieren que probablemente las diferencias en cuanto a fenotipo y genotipo, así como las diferencias en las preferencias de sustratos energéticos de cardiomiocitos neonatos y adultos podrían constituir razones por las cuales ambos tipos celulares se comportan de manera distinta en cuanto a la relación insulina y calcio. En conclusión, insulina activa su vía transduccional en el cardiomiocito adulto. No obstante, ni insulina ni IGF-1 inducen cambios en los niveles intracelulares de calcio en el cardiomiocito adulto ya sea afectando la entrada desde el extracelular o la salida desde reservorios intracelulares de manera detectable con Fluo3- AM. Sin embargo, dado que este catión moduló la activación de la vía de señalización de insulina a nivel de la proteína kinasa Akt, futuras investigaciones deberán aclarar estas discrepancias

Cardiomyocytes are fully differentiated cells with limited proliferation capacity and responsible for myocardial contraction. Ca2+ and cyclic AMP are second messengers regulating cardiomyocyte contraction. On the other hand type II diabetes mellitus has been associated with increased cardiovascular risk (diabetic cardiomyopathy), being frequent systolic and diastolic alterations in the diabetic heart. Because insulin is the main hormone linked to diabetes, it is important to determine whether there is any relationship between this peptide hormone and calcium in the adult cardiomyocyte. In a previous work in our laboratory, we reported that insulin increased intracellular Ca2+ in primary cultured neonatal cardiomyocytes. This response has two components, a rapid one characterized by its dependence by external Ca2+ and the L-type Ca2+ channel/ryanodine receptor, and a slow component depending on IP3/IP3 receptor signaling pathway. Interestingly the latter component mediates insulin effects on GLUT4 translocation to the plasma membrane and subsequent glucose uptake. Based on this evidence, we propose that insulin also increases intracellular Ca2+ levels in isolated adult rat cardiomyocytes through a mechanism involving extracellular and intracellular Ca2+. The aim of this work was to study the activation of insulin receptor downstream signaling pathway and its regulation by Ca2+ as well as the effects of insulin and IGF-1 on the intracellular Ca2+ levels in isolated adult rat cardiomyocytes. To this end, cells were exposed to 100 nM insulin for different time periods and the activation of the insulin receptor was assessed by its tyrosine autophosphorylation and the phosphorylation of protein kinases Akt (Ser 473) and Erk 1/2 by Western Blot. The presence of tyr1150/1151 insulin receptor in the adult rat cardiomyocyte was investigated by indirect immunofluorescence. These three signaling proteins reached a maximum activation at 5 min after insulin stimulation. On the other hand, cells preincubated with the fluorescent probe for calcium Fluo3-AM were studied by confocal microscopy to determine changes on intracellular Ca2+ levels induced by insulin and IGF-1. Both peptides did not produce any significant increases in intracellular calcium levels both in presence and absence of extracellular calcium and evaluating different cell areas and concentrations of the compounds. Stimuli like ionomycin and KCl, used as positive controls, increased intracellular Ca2+ levels in cardiac cells. Furthermore, insulin and IGF-1 did not affect the frequency of adult cardiomyocyte contraction. However, Akt phosphorylation on Ser 473 was lower in cells cultured with the intracellular calcium chelator BAPTA-AM that those cultured with medium containing this cation. In contrast, insulin receptor phosphorylation was not modified by BAPTA-AM on isolated adult rat cardiomyocytes. These results suggest that probably the differences in phenotype and genotype, as well as differences in energy substrate preferences by neonatal and adult cardiomyocytes could explain why both cell types behave differently with regard to the relationship between insulin and calcium. In summary, insulin activates its canonical signaling pathway in adult cardiomyocytes. However, neither insulin nor IGF-1 changed intracellular Ca2+ levels in isolated rat adult cardiomyocytes. However Ca2+ modulated the activation of the canonical insulin receptor signaling pathway at the level of Akt and future research should clarify these discrepancies