Especies reactivas de oxígeno en la regulación de volumen y muerte del cardiomiocito activada por estrés hiposmótico

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares isquémicas son una de las principales causas de muerte en Chile. En estas patologías, los cardiomiocitos están expuestos a privación de nutrientes, hipoxia y estrés osmótico. Nuestro laboratorio ha estudiado el efecto del estrés hiperosmótico sobre el cardiomiocito. Sin embargo se desconocen las consecuencias del estrés hiposmótico ya que a diferencia de otros tipos celulares, las células cardíacas no están expuestas fisiológicamente a grandes fluctuaciones en la osmolaridad externa. Durante los procesos de isquemia y reperfusión, los cardiomiocitos se exponen a estrés oxidativo, desbalance redox intracelular e hiposmolaridad, pudiendo ser las consecuencias de esta última muy severas para el corazón, debido a los cambios electrofisiológicos que acompañan al hinchamiento celular. Este aumento del volumen celular es especialmente marcado durante la reperfusión, evento indispensable para reestablecer la irrigación sanguínea y rescatar al miocardio. Esta memoria estudió el efecto de las especies reactivas de oxígeno en la regulación del volumen y muerte activada por estrés hiposmótico en cardiomiocitos.

Nuestros resultados a través de calceína-AM y microscopia confocal, muestran que cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a estrés hiposmótico con soluciones 248 ó 202 mOsm (medio de cultivo diluido 15% y 30% con agua), aumentaron su volumen en un 40 y 60%, respectivamente. Estas células no presentaron disminución regulada de volumen (RVD) espontáneamente, ni en presencia de gramicidina (inductor de RVD). El estrés hiposmótico generó especies reactivas del oxígeno (ROS), evaluada por diclorofluoresceina, siendo el radical hidroxilo la principal especie radicalaria detectada por resonancia de espín electrónico (ESR), usando el atrapador 5,5-dimetilpirrolina 1-óxido. El origen de ROS se determinó observando el efecto de apocinina (inhibidor NADPH oxidasa), rotenona (inhibidor mitocondria), alopurinol (inhibidor xantino oxidasa) y N-acetil-cisteína sobre la oxidación de diclorofluoresceina (DCF-DA). Los resultados muestran que sólo apocinina inhibió la generación de ROS dependiente del estrés hiposmótico. Mediante ESR y células transducidas con AdCAT (catalasa), AdSOD1(superóxido dismutasa citosólica), AdSOD2 (superóxido dismutasa mitocondrial) y AdGPx (glutatión peroxidasa) se identificó a NADPH oxidasa como principal fuente de las ROS. Por otra parte, su generación también se asoció a una disminución en el nivel total de GSH desde los 60 min post-estímulo, siendo significativo a las 4 h, para 202 mOsm. El estrés hiposmótico disminuyó la viabilidad de los cardiomiocitos, determinada por azul de tripán, a las 6 h en un 45 y 40% según el nivel de hiposmolaridad, A diferencia del estrés hiperosmótico no se detectó activación de las caspasas 9 y 3, sugiriendo la existencia de una muerte independiente de caspasas. Dado que no se evaluaron otros parámetros de muerte, aún se desconoce la participación de necrosis o autofagia en la muerte de los cardiomiocitos activada por estrés hiposmótico. La viabilidad celular se recuperó en células transducidas con AdCAT y expuestas a estrés hiposmótico. Además en estas células hubo un RVD parcial. En conclusión, los resultados indican que el estrés hiposmótico aumenta el volumen del cardiomiocito, siendo NADPH oxidasa una de las principales fuentes en la generación de ROS. Estos últimos inhiben el mecanismo de RVD y median la muerte celular estimulada por el estrés hiposmótico.