Caveolina-1 reduce la transcripción dependiente de hif1α en un mecanismo dependiente del óxido nítrico en células tumorales

Abstract

El cáncer es la 2° causa de muerte en Chile. El desarrollo del cáncer se ha propuesto que es consecuencia de la pérdida de función de los genes supresores de tumores beneficiando la acción de los oncogenes (genes que promueven el crecimiento de tumores). La activación del Factor inducible por hipoxia 1α (HIF1α) en un ambiente reducido en oxígeno (hipoxia) o por óxido nítrico (NO), permiten la proliferación y adaptación metabólica de las células tumorales. Por otro lado, Caveolina-1 es una proteína de andamiaje, que ha sido descrita como un supresor de tumores y promotor de metástasis. Resultados de nuestro laboratorio han demostrado que E-Cadherina y Caveolina-1 actúan cooperativamente en supresión de tumores in vivo. Sin embargo, Caveolina-1 suprime el crecimiento de tumores incluso en células carentes de E-Cadherina, de un modo menos eficiente. La isoforma endotelial de la sintasa de óxido nítrico (NOS3), es uno de los blancos inhibidos por Caveolina-1 más ampliamente descritos en la literatura, que recientemente ha sido implicado en mantenimiento tumoral. Cómo la inhibición de NOS mediada por Caveolina-1 afecta la activación de HIF1α contribuyendo a la función supresora de tumores de Caveolina-1 en ausencia de E-Cadherina, aún no ha sido evaluado. En este trabajo, evaluamos la posibilidad que la inhibición de NOS por Caveolina-1 pueda reducir la transcripción dependiente de HIF1α y contribuir así a la función supresora de tumores de Caveolina-1. Líneas celulares transfectadas con un plasmidio que codifica para Caveolina-1 [HT29(US), B16F10 y HEK293T] o células en que la expresión endógena de Caveolina-1 fue disminuida utilizando un shRNA [MDA-MB231], fueron tratadas en hipoxia (1% O2, 4-24 h). La actividad transcripcional de HIF, la expresión de genes blanco de HIF1α, la distribución subcelular de HIF1α, Caveolina-1 y NOS3, fueron evaluados mediante ensayos de gen reportero, RT-PCR/qPCR, Western Blot y microscopía confocal, respectivamente. Además, se realizaron ensayos de formación de tumores en ratones inmunosuprimidos SCID-Beige y en ratones inmunocompetentes C57BL/6. Los principales hallazgos de este trabajo fueron, que Caveolina-1 reduce la actividad transcripcional de HIF1α y la expresión de VEGF en hipoxia en las líneas celulares analizadas. Además, la reducción del crecimiento tumoral de células de melanoma murino B16F10(Cav-1) fue coincidente con la reducción de la expresión del mRNA de vegf in vivo. El tratamiento de las células con el dador de NO (DETA/NO) o el inhibidor de arginasa BEC, previnieron la inhibición de la actividad transcripcional de HIF1α mediada por Caveolina-1. Además, la inhibición de NOS con L-NAME o con el inhibidor selectivo de NOS3, L-NIO, reducen el incremento en la actividad transcripcional de HIF en hipoxia. In vivo, la sobreexpresión de HIF1α en células HT29(US)(Cav-1) revierte la supresión de tumores mediada por Caveolina-1 en ratones SCID-Beige. Finalmente, el tratamiento sistémico de ratones C57BL/6 con L-NAME, reduce el volumen tumoral a niveles comparables con los observados en los tumores formados por células B16F10(Cav-1). En resumen, nuestros resultados sugieren que la inhibición de NOS3 mediada por Caveolina-1 reduce la actividad transcripcional de HIF1α y la expresión de sus genes blanco, in vitro e in vivo, contribuyendo a la función supresora de tumores de Caveolina-1 en ausencia de E-Cadherina

Cancer, the 2nd most important cause of death in Chile, is thought to develop due to loss of tumor suppressor and gain of oncogene function. Activation of Hypoxia-inducible factor 1α (HIF1α) in the low oxygen environment (hypoxia) present in tumors or by nitric oxide (NO), favors cancer cell proliferation and metabolic adaptation. Caveolin-1 is a scaffolding protein that reportedly functions both as a tumor suppressor and promoter of metastasis. Results from this laboratory have shown that E-cadherin and Caveolin-1 cooperate in tumor suppression in vivo. However, Caveolin-1 expression suppresses tumor growth even in cancer cells lacking E-cadherin, albeit less efficiently. The endothelial isoform of nitric oxide synthase (NOS3), one of the best-established targets for inhibition by Caveolin-1, has recently been implicated in maintence of tumor growth. Whether, Caveolin-1-mediated NOS inhibition may impact on HIF1α activation and account for tumor suppression by Caveolin-1 in the absence of E-cadherin has not been yet assessed. Here, we evaluated the possibility that NOS inhibition by Caveolin-1 may reduce HIF1α - dependent transcription and thereby contribute to the tumor suppressor function of Caveolin-1. Cell lines transfected with a Caveolin-1-encoding plasmid [HT29(US), B16F10 and HEK293T] or cells where endogenous Caveolin-1 protein levels [MDA-MB231] were reduced using shRNA-technology, were exposed to hypoxia (1% O2, 4-24 h). In these cells, HIF transcriptional activity, HIF1α target-gene expression, HIF1α, Caveolin-1 and NOS3 protein levels and subcellular localization were evaluated by gene reporter assays, RT-PCR/qPCR, Western Blot and confocal microscopy, respectively. Tumor forming capacity was evaluated in immunodeficient SCID-Beige and immunocompetent C57BL/6 mouse strains. The main findings of this study are that Caveolin-1 reduced HIF1α transcriptional activity and VEGF expression in hypoxia in vitro in all cell lines. Also, reduced tumor growth of B16F10(Cav-1) melanoma cells in C57BL/6 mice correlated with reduced vegf gene expression in vivo. Treatment of cells with the NO donor (DETA/NO) o arginase inhibition with BEC, prevented Caveolin-1-mediated inhibition of HIF1α transcriptional activity. Furthermore, NOS inhibition with L-NAME or selective NOS3 inhibition with L-NIO, reduced hypoxia-enhanced HIF transcriptional activity. In vivo HIF1α overexpression in HT29(US)(Cav-1) cells reversed tumor suppression due to Caveolin-1 in SCID-Beige mice. Finally, systemic treatment of C57BL/6 mice with L-NAME, reduced tumor volumes to levels comparable to those observed for tumors formed by B16F10(Cav-1) cells. In summary, our observations suggest that Caveolin-1-mediated inhibition of NOS3 activity reduces HIF1α transcriptional activity and target gene expression, both in vitro and in vivo, and that this ability contributes to tumor suppression by Caveolin-1 in the absence of E-cadherin