Papel de la gtpasa endosomal rab5 en la localización nuclear de β-catenina en displasia oral

Abstract

RESUMEN La displasia oral reúne un conjunto de alteraciones celulares y tisulares en el epitelio oral, cuyo diagnóstico está generalmente relacionado con una mayor tasa de transformación maligna hacia el cáncer. Una de las vías de señalización alterada en la carcinogénesis oral, es la vía Wnt Canónica, en donde la proteína β-catenina es su componente central. Al activarse la vía Wnt, β-catenina no es fosforilada y se estabiliza en el citoplasma, llevando a su posterior translocación nuclear, incrementando la transcripción de genes relacionados con la tumorigénesis. La pérdida en la regulación de β-catenina es comúnmente asociada a diversos tipos de cáncer, y lesiones potencialmente malignas, como en colon, sin embargo en displasia oral se desconoce si existen alteraciones en la actividad transcripcional de β-catenina, y menos aún se conoce el posible mecanismo involucrado en su translocación nuclear. En modelos no tumorales, se ha propuesto que el tráfico endocítico juega un papel clave en la activación de la vía Wnt canónica, a través del secuestro de proteínas claves para la degradación de β-catenina en endosomas tempranos, y en donde proteínas reguladoras del tráfico endocítico, como Rab5, podrían jugar un papel potencial en la translocación nuclear de β-catenina. Según lo anterior, existe la posibilidad de que Rab5 contribuya en la progresión tumoral, y específicamente en etapas tempranas de la carcinogénesis oral. Sin embargo, no se ha demostrado la relevancia de Rab5 en el desarrollo de la displasia oral. En base a lo anteriormente señalado, se propone la siguiente hipótesis: “la activación de Rab5 promueve la translocación nuclear de β-catenina, a través del reclutamiento de su complejo de destrucción hacia endosomas tempranos en displasia oral”. El objetivo general de este proyecto es determinar si la translocación nuclear de β-catenina en displasia oral depende de la activación de Rab5 y del reclutamiento del complejo de destrucción hacia endosomas tempranos. Para esto, los objetivos específicos son: (1) Determinar el efecto de ligandos Wnt en la localización de β-catenina en células de displasia oral; (2) Analizar el efecto de la activación de Rab5 en la localización nuclear de β-catenina en células de displasia oral; (3) Determinar si la actividad de Rab5 es necesaria para el reclutamiento de componentes del complejo de destrucción de β-catenina hacia endosomas tempranos en células de displasia oral; (4) Evaluar la localización endosomal de GSK-3β en biopsias de displasia oral con presencia nuclear de β-catenina. En esta tesis hemos demostrado una mayor presencia nuclear de β-catenina en células DOK (línea celular de displasia oral moderada), en comparación a células OKF-6/TERT2 (línea celular de queratinocitos orales no tumorales) y CAL-27 (línea celular de carcinoma oral de células escamosas), así como también un enriquecimiento de β-catenina total y β-catenina no fosforilada en fracciones nucleares de células DOK. Adicionalmente, el medio condicionado de células DOK previamente tratadas con el inhibidor de la porcupina C-59, el cual inhibe la secreción de ligandos Wnt, presentó un menor nivel de Wnt3a secretado, en comparación con la condición no tratada. Adicionalmente las células DOK tratadas con C-59 presentaron una menor acumulación de β-catenina nuclear, y menores niveles totales de β-catenina no fosforilada, así como una disminución en los niveles de ARNm y proteína para los genes diana de β-catenina (survivina y ciclina D1). El tratamiento, ya sea de células OKF-6 o de queratinocitos orales primarios, con medio condicionado de células DOK, indujo una mayor localización y actividad transcripcional de β-catenina. Para finalizar los resultados del objetivo específico 1, se observó que tejidos de displasia oral severa presentaron localización nuclear de β-catenina y paralelamente un aumento de Wnt3a, en comparación con mucosa sana. Por su parte, resultados del objetivo específico 2 demostraron mayores niveles de la fracción activa de Rab5 en células DOK en comparación a células OKF-6, mientras que la transfección de células DOK con GFP-Rab5/S34N (mutante inactiva de Rab5) causó una disminución en la localización nuclear de β-catenina. Los resultados relacionados con el objetivo específico 3 indican que efectivamente hay co-localización entre el marcador de endosomas tempranos (EEA1) y proteínas del complejo de destrucción de β-catenina en células DOK, sin embargo, esta co-localización disminuye significativamente cuando éstas células son transfectadas con la mutante inactiva de Rab5. Por último, y en relación al objetivo específico 4 se demostró simultáneamente presencia nuclear de β-catenina y localización endosomal de GSK-3β en tejidos de displasia oral severa, en comparación a tejidos de mucosa oral sana. En conclusión, esta tesis demuestra por primera vez cómo el tráfico endocítico se relaciona con la señalización Wnt canónica, induciendo la translocación nuclear de β-catenina y contribuyendo así a la progresión tumoral en etapas tempranas de la carcinogénesis oral.