Efecto del condensado del humo del cigarrillo (CSC) sobre fibroblastos mamarios humanos de origen estromal

Abstract

El cáncer de mama es una enfermedad multifactorial en la que el microambiente tumoral y el estroma mamario desempeñan un papel clave en su progresión. Entre los factores ambientales que pueden influir en este proceso se encuentra el humo del cigarrillo, cuyos compuestos pueden inducir alteraciones celulares y moleculares. En este estudio, se evaluó el efecto del condensado del humo del cigarrillo (CSC) sobre una línea celular de fibroblastos mamarios humanos (RMF-621), con el objetivo de determinar su impacto sobre la respuesta al daño genómico y la posible inducción de un fenotipo proinflamatorio y profibrótico, característico del nicho tumoral. Las células RMF-621 se expusieron a CSC y se analizaron marcadores de respuesta al daño en el ADN (H2AX, ATM, p53) mediante Western Blot e Inmunofluorescencia, así como la expresión de genes proinflamatorios (IL-1β, IL-6, CCL2, COX-2) y profibróticos (TGF-β1, Col-I, CTGF, FN) mediante qPCR y Western Blot. Además, se evaluó la expresión y actividad de metaloproteinasas de matriz (MMP-2 y MMP-9) mediante qPCR y Zimografía respectivamente. Los resultados mostraron que el CSC no indujo cambios significativos en los marcadores de daño genómico ni en la expresión de mediadores inflamatorios, indicando que el tratamiento utilizado no logró activar una respuesta al daño al ADN, ni una respuesta inflamatoria relevante en las células tratadas. Sin embargo, se observó una disminución significativa en la expresión de marcadores miofibroblásticos, sugiriendo una reducción en la activación de fibroblastos y en la modulación de la matriz extracelular, lo que también se confirmó con la menor expresión proteica de Fibronectina. No obstante, el aumento de TGF-β1 ratificaría su papel clave en la fibrosis, lo que debería ser explorado más a fondo. Además, aunque la expresión de MMP-2 y MMP-9 no mostró variaciones, la actividad enzimática de MMP-2 presentó una disminución significativa. Finalmente, mediante inmunofluorescencia (IF) pudimos observar que solo algunas células estromales sufrieron daño con el tratamiento, lo que podría haber afectado la detección de cambios en marcadores inflamatorios y de remodelación de la matriz extracelular mediante técnicas que analizan un pool celular como WB y qPCR. El uso de Dimetilsulfóxido (DMSO) como solvente del CSC se consideró como limitante del estudio, ya que, este compuesto mostró efectos citotóxicos sobre las células RMF-621 lo que pudo haber interferido en los resultados obtenidos. Se sugiere que esta línea celular es particularmente sensible al DMSO, lo que podría haber alterado la interacción entre el CSC y las células. En conclusión, el CSC no generó el efecto esperado en todos los marcadores evaluados, pero los cambios en la matriz extracelular y la actividad de MMP-2, sugieren una influencia compleja en el estroma mamario. Se requieren estudios más representativos que consideren la interacción con el microambiente tumoral y metodologías para analizar respuestas celulares de manera individual

Breast cancer is a multifactorial disease in which the tumor microenvironment and mammary stroma play a key role in its progression. Among the environmental factors that may influence this process is cigarette smoke, whose compounds can induce cellular and molecular alterations. In this study, the effect of cigarette smoke condensate (CSC) was evaluated on a human mammary fibroblast cell line (RMF-621) to determine its impact on the genomic damage response and the potential induction of a pro-inflammatory and pro-fibrotic phenotype, characteristic of the tumor niche. RMF-621 cells were exposed to CSC, and markers of DNA damage response (H2AX, ATM, p53) were analyzed by Western Blot and Immunofluorescence, as well as the expression of pro-inflammatory (IL-1β, IL-6, CCL2, COX-2) and pro-fibrotic (TGF-β1, Col-I, CTGF, FN) genes by qPCR and Western Blot. Additionally, the expression and activity of matrix metalloproteinases (MMP-2 and MMP-9) were evaluated using qPCR and Zymography, respectively. The results showed that CSC did not induce significant changes in genomic damage markers or in the expression of inflammatory mediators, indicating that the treatment used failed to activate a DNA damage response or a relevant inflammatory response in the treated cells. However, a significant decrease in the expression of myofibroblast markers was observed, suggesting a reduction in fibroblast activation and extracellular matrix modulation, which was also confirmed by the lower protein expression of Fibronectin. Nonetheless, the increase in TGF-β1 would confirm its key role in fibrosis, which should be further explored. Furthermore, although the expressions of MMP-2 and MMP-9 did not show variations, the enzymatic activity of MMP-2 was significantly reduced. Finally, through immunofluorescence (IF), we observed that only some stromal cells were damaged by the treatment, which may have affected the detection of changes in inflammatory markers and extracellular matrix remodeling using techniques that analyze a cell pool, such as WB and qPCR. The use of Dimethyl Sulfoxide (DMSO) as a solvent for CSC was considered a limitation of the study since this compound exhibited cytotoxic effects on RMF-621 cells, which may have interfered with the obtained results. It is suggested that this cell line is particularly sensitive to DMSO, which could have altered the interaction between CSC and the cells. In conclusion, CSC did not produce the expected effect on all evaluated markers, but the changes in the extracellular matrix and MMP-2 activity suggest a complex influence on the mammary stroma. More representative studies are needed, considering interactions with the tumor microenvironment and methodologies for analyzing cellular responses individually.