Inhibición del mRNA de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2) de rata in vivo mediante una ribozima de horquilla codificada en un vector adenoviral

Abstract

El alcoholismo está determinado por factores genéticos y medioambientales. El factor genético principal corresponde a los genes que codifican las enzimas que metabolizan el alcohol. El metabolismo hepático del etanol contempla la oxidación del etanol a acetaldehído mediante la deshidrogenasa alcohólica y la posterior oxidación del acetaldehído a acetato, llevada a cabo fundamentalmente por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2).

Un 30-40 % de la población oriental presenta una mutación que genera una ALDH2 sin actividad; al beber alcohol, estos individuos sufren un aumento en el nivel de acetaldehído sanguíneo, lo que trae como consecuencia efectos disfóricos que generan aversión por el alcohol. El fármaco disulfiram, utilizado para el tratamiento del alcoholismo, imita este fenotipo asiático ya que inactiva covalentemente a la ALDH2.

Sin embargo, su eficacia farmacológica está contrarrestada por la variabilidad individual, la toxicidad, el requerimiento de ingesta diaria y por la necesidad de que el paciente se comprometa a medicarse. El desarrollo de fármacos alternativos más específicos y de mayor duración es concebible en base a disminuir la cantidad de la enzima ALDH2 disminuyendo la expresión de su gen. Ello se puede efectuar con moléculas capaces de degradar el mRNA de la ALDH2 como las ribozimas, moléculas de RNA que reconocen su blanco por enlaces de Watson y Crick y lo cortan en una secuencia específica.

En este trabajo de tesis se determinó si la ribozima de horquilla RzCG20 ―capaz de disminuir la actividad de la ALDH2 en células de hepatoma de rata en cultivo― es capaz de producir el mismo efecto in vivo al entregar, en un vector adenoviral, un gen que codifica dicha ribozima a ratas UChB dependientes de alcohol, de manera que al consumirlo sufran un aumento del acetaldehído sanguíneo cuyos efectos aversivos disminuyan el consumo voluntario de alcohol.

Se produjeron y purificaron vectores adenovirales que codifican la ribozima RzCG20, la ribozima control RzCG20c diseñada para unirse a su blanco sin degradarlo, o un RNA no funcional control. Se transdujeron células de hepatoma de rata en cultivo con las preparaciones adenovirales obtenidas para asegurar que eran biológicamente activas, es decir, que eran capaces de disminuir la actividad de la ALDH2.

En experimentos in vivo, los vectores adenovirales se inyectaron en la vena de la cola de ratas que voluntariamente beben gran cantidad de alcohol (ratas UChB), determinándose que una sola administración del vector adenoviral codificante de la ribozima RzCG20 a ratas UChB (n=5) disminuye en ~50 % el consumo de alcohol durante 34 días de un periodo de acceso restringido a etanol (1 h al día). Igual efecto se obtuvo con el adenovirus codificante de la ribozima control RzCG20c; el adenovirus control y el vehículo no disminuyeron el consumo. A los 39 días postinyección, las ratas que recibieron los vectores adenovirales codificantes de las ribozimas evidenciaron una reducción de ~24 % en la actividad de la ALDH2 hepática (medición espectrofotométrica) y un aumento en el acetaldehído sanguíneo dos veces mayor que los animales controles (según cromatografía de gases) luego de una administración intraperitoneal de alcohol (1 g/kg).

En conclusión, se demostró actividad biológica específica in vivo de la ribozima RzCG20 y la ribozima control RzCG20c para silenciar el mRNA de la ALDH2: ambas ribozimas lograron una disminución parcial de la actividad de la ALDH2 sin afectar la actividad de otras ALDHs. Las posibles diferencias mecanísticas entre las ribozimas no se manifestaron en sus efectos bioquímicos sugiriendo que la sola unión de la ribozima control RzCG20c a los 17 nucleótidos reconocidos en el mRNA de la ALDH2 es suficiente para reducir, por bloqueo del mRNA, la actividad de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial en un grado que permite disminuir el consumo de alcohol. En suma, el desarrollo de una terapia génica para el alcoholismo disminuyendo la expresión del mRNA de la ALDH2 mediante ribozimas de horquilla es promisorio.