Caracterización morfológica de la microglía y los astrocitos en respuesta al patógeno oral Aggregatibacter actinomycetemcomitans o a agregados del péptido beta-amiloide

Abstract

La periodontitis corresponde a una patología caracterizada por una inflamación mediada por el huésped asociada a microbios, que resulta en pérdida de inserción periodontal. Las bacterias asociadas en este proceso podrían generar bacteremias conllevando a patologías de tejidos específicos. Se ha evidenciado una relación entre periodontitis y otras patologías como la enfermedad de Alzheimer donde la periodontitis podría generar neuroinflamación. La Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) es uno de los periodontopatógenos más potentes y se ha asociado a enfermedades periodontales graves, agresivas y de inicio temprano. Aa es conocida por su capacidad de evadir la respuesta inmune. Sus lipopolisacáridos interfieren con las defensas del huésped y determinan diferentes serotipos bacterianos. De los siete serotipos de Aa identificados, a, b y c son los más frecuentes en la cavidad oral. El serotipo c se asocia más frecuentemente a sujetos sanos y el b, a mayor severidad en la patología oral. A pesar de que ya se ha reportado la presencia de Aa en abscesos cerebrales, poco se conoce de los efectos que esta bacteria puede causar sobre las neuronas y células de la glía. En nuestro laboratorio estudiamos los efectos de los serotipos a, b y c sobre cultivos primarios de hipocampo o corteza de rata, modelos experimentales utilizados para estudiar el funcionamiento de las células cerebrales tanto en contexto de salud, como de enfermedad. Nuestro grupo reportó que el serotipo b, así como en el contexto oral, es también el más agresivo para los cultivos hipocampales, causando una severa reducción de las prolongaciones neuronales y secreción de moléculas pro-inflamatorias. En el presente estudio el objetivo fue estudiar en detalle si los LPS de diferentes serotipos de Aa causan alteraciones a la morfología glial, comparando con los efectos causados por oligómeros del péptido beta-amiloide a estas células, que son agregados proteicos que funcionan como toxinas sinápticas en el contexto de la enfermedad de Alzheimer, que afecta severamente a la función hipocampal. A pesar de que existen diversas estrategias para estudiar cambios en la morfología neuronal (como el análisis de Sholl), los cambios en glia han sido mucho menos estudiados, demandando el desarrollo y prueba de distintas estrategias para la observación y caracterización de cambios significativos en su morfología. Materiales y métodos: Cultivos primarios de astrocitos y/o microglía de hipocampo o corteza de rata fueron obtenidos como descrito en trabajos previos de nuestro laboratorio. Una vez aislados, los cultivos fueron tratados con 50 ug/mL de LPS de los serotipos a, b y c de Aa o con 500 nM de AβOs (concentración subletal) por 48 h. Para los controles negativos se trataron las células con el vehículo del LPS bacteriano o de los AβOs. Tras fijación con paraformaldehído 4%, los astrocitos fueron inmunomarcados con anticuerpos específicos contra la proteína acídica fibrilar glial y la microglía, con anticuerpos contra la molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1. Para estudiar la morfología glial, se evaluó con el software ImageJ (NIH) parámetros que permiten obtener información morfológica a 2 dimensiones, como la dimensión fractal, la lagunaridad, la 7 densidad y el perímetro celulares. Asimismo, a través de la adaptación del análisis Sholl para células de la glía, se calcularon intersecciones máximas y el radio crítico de las células. Resultados: Con los análisis morfológicos que utilizamos para estudiar la morfología glial, solo observamos cambio significativo en uno de los parámetros utilizados, y bajo una única condición experimental. Observamos una disminución significativa de las intersecciones máximas de los astrocitos expuestos a los AβOs, comparados con su respectivo control. En los demás parámetros, y bajo el estímulo de los diferentes serotipos de Aa, no se observan cambios significativos, al menos en los parámetros analizados. Conclusiones: La exposición de cultivos primarios de astrocitos y microglía de rata al LPS de diferentes serotipos de Aa no causa cambios significativos en la dimensión fractal, la lagunaridad, la densidad y el perímetro celulares. Asimismo, no se observaron cambios en las células de la glía cuando se calcularon las intersecciones máximas y el radio crítico utilizando una adaptación del análisis de Sholl para las células de la glía. Sin embargo, observamos que los AβOs generan una disminución en la cantidad de intersecciones máximas en comparación a los astrocitos control. Así, con el estímulo neurotóxico de los AβOs, la adaptación del análisis de Sholl para los astrocitos permitió detectar cambios morfológicos significativos al menos en uno de los parámetros estudiados.