Efecto del ADN de Porphyromonas endodontalis sobre el fenotipo inflamatorio y participación de TLR -9 en macrófagos humanos

Abstract

Introducción: La periodontitis apical es una condición osteolítica inflamatoria-infecciosa que afecta al periodonto apical. Si bien, Porphyromonas endodontalis es un patógeno clave, definido en base a su prevalencia y factores de virulencia, se desconoce el efecto del ácido desoxirribonucleico (ADN) de Porphyromonas endodontalis en la respuesta inflamatoria mediada por Porphyromonas endodontalis, así como los receptores involucrados en su reconocimiento y la posible interacción potencial entre ellos. Objetivo: Evaluar in vitro si el ADN de P. endodontalis induce una respuesta proinflamatoria mediada por TLR-9 en macrófagos humanos. Metodología: Macrófagos diferenciados de monocitos humanos de línea THP-1 fueron estimulados con ADN (100 μg ml−1) de aislado clínico endodóntico o una cepa de referencia de Porphyromonas endodontalis. Se determinó la expresión génica de TNF-α , IL-1β, IL-6, IL-12, IL-10, y TLR-9, -2 y -4 por RT q-PCR. Los niveles de activación de NF-kB se determinaron mediante la fosforilación de la subunidad p65 por Inmuno Western blot y su traslocación al núcleo, usando inmunofluorescencia. Finalmente se evaluó la participación de TLR-9, 2 y 4 mediante el uso de un inhibidor de TLR-9 (ODN INH-18; 1 µM) y un inhibidor de TLR-2 y 4 (OxPAPC; 30 μg ml−1). Como control negativo se utilizaron células sin estimular expuestas a medio sin ADN de P. endodontalis . Como control positivo se utilizó un agonista de TLR-9 (ODN 2006; 2,5 µM). Cada experimento se realizó 3 veces y en triplicado. El análisis estadístico de los resultados se realizó por la prueba de ANOVA o Kruskal-Wallis según la distribución de los datos. Resultados: Los macrófagos estimulados con ADN de la cepa de referencia P. endodontalis ATCC 35406 indujeron aumento de mRNA de TNF-α e IL-6, mientras que el aislado clínico indujo aumentos de mRNA de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-10 por encima del control sin estimular. Respecto de la participación de TLR-9 en la respuesta inflamatoria inducida por el ADN de P. endodontalis, si bien no se observaron cambios en los niveles de mRNA de TLR-9, el ADN de P. endodontalis indujo la activación de NF-kB vía TLR-9, la que fue más marcada para el aislado clínico. Además, existió participación de TLR-9 en la expresión génica de IL-6 por ADN de ATCC 35406 y del aislado clínico de P. endodontalis. Nuestros resultados sugieren también la participación TLR-2 y 4 en la respuesta inducida por ADN de P. endodontalis, lo que se evidenció en la disminución de la expresión de TNF-α, IL-1β e IL-6 al inhibir estos receptores. Conclusión: El ADN de P. endodontalis induce una respuesta proinflamatoria mediada por TLR-9 y señalización vía NF-kB, e involucraría la participación de TLR-2 y/o 4 en macrófagos humanos.